本发明涉及一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，属分子标记领域。首先剪取真鲷雌鱼和黑鲷雄鱼亲本及其杂交后代尾鳍样品，进行DNA的提取，然后以亲本和杂交后代的DNA为模板，采用微卫星标记引物进行多重PCR扩增；对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，用BandScan5.0软件分析，结合PCR产物长度判断等位基因大小，确定个体基因型，根据分析结果建立杂交鲷及亲本的基因型数据文件；利用Cervus3.0软件进行家系判别。本发明采用微卫星标记技术，在10个微卫星座位上区分杂交用雌雄亲本和后代基因型，可以准确、便捷地确定杂交鲷后代的家系来源，快速高效地选育出优良的杂交鲷家系，为遗传育种工作带来极大的便利。 

1、一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）剪取真鲷雌鱼和黑鲷雄鱼亲本及其杂交后代尾鳍样品，进行基因组DNA的提取；
（2）以步骤（1）中亲本和杂交后代的DNA为模板，采用微卫星标记引物进行多重PCR扩增；
（3）对步骤（2）的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，电泳图谱用BandScan5.0软件分析，结合PCR产物长度判断等位基因大小，确定个体基因型；
（4）根据步骤（3）的分析结果建立杂交鲷及其亲本的基因型数据文件；
（5）利用Cervus3.0软件进行家系判别。
2、如权利要求1所述利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，其特征在于，所述微卫星标记引物有10组，微卫星标记引物1的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，标记位点为AS1；
微卫星标记引物2的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示，标记位点为AS2；
微卫星标记引物3的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示，标记位点为AS3；
微卫星标记引物4的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示，标记位点为AS4；
微卫星标记引物5的上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID NO.10所示，标记位点为AS5；
微卫星标记引物6的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如SEQ ID NO.12所示，标记位点为AS6；
微卫星标记引物7的上游引物序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物序列如SEQ ID NO.14所示，标记位点为AS7；
微卫星标记引物8的上游引物序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物序列如SEQ ID NO.16所示，标记位点为AS8；
微卫星标记引物9的上游引物序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物序列如SEQ ID NO.18所示，标记位点为AS9；
微卫星标记引物1的上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物序列如SEQ ID NO.20所示，标记位点为AS10。
3、如权利要求1所述利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增的反应体系（25µL）为：ddH2O 17.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP 0.5μL，引物 2μL，基因组DNA  1μL，Mg2+  1.5μL，Taq酶 0.25μL。
    4、如权利要求1所述利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增的反应条件为：94℃预变性10 min；94℃变性 40 s、57.8-62.0℃退火40 s；72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。
5、如权利要求1或2或3或4所述利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用的是8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶。
一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法
 
技术领域
    本发明涉及一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，属于分子标记技术领域。
背景技术
黑鲷(Acantho pagrusschlegelii)体形为长椭圆形、侧扁，体态优雅、色泽素丽、肉质鲜美，是一种名贵的海产鱼类。黑鲷鱼的抗逆性强，对温度、盐度适应范围广，但养殖周期长、抗病力差。近年来由于没有对种鱼进行选育和改良，种质资源已经开始出现衰退，病害日趋严重、品质下降，经济效益明显下滑，影响了黑鲷养殖业的稳定与持续发展。真鲷(Pagrosomus major)为近海暖温性底层肉食性鱼类，具有生长快、便于暂养、经济价值高等特点，是一种名贵的海水养殖鱼种。近年来，真鲷的人工养殖试验已取得了一定的成果，在我国南方沿海地区已经发展成为一种主要的海水养殖鱼种。但真鲷抗逆性差、不耐低温。因此，可以期望通过杂交育种的方式，将真鲷与黑鲷进行杂交，使得杂交鲷产生杂种优势，克服亲本不耐低温、生长偏慢的缺点。2014、2015年江苏省海洋水产研究所科研人员在江苏省海水增养殖技术及种苗中心开展了真鲷黑鲷的杂交育种技术研究，以真鲷雌鱼和黑鲷雄鱼为亲本，采用人工授精的方法，成功获得了杂交后代，建立了杂交鲷家系。杂交后代具有体型标准、生长快、易起捕、不饱和脂肪酸含量高等特点，是沿海海水鱼类试验养殖的对象。
在鱼类良种选育过程中，搞清楚种群中的亲子关系或系谱关系，能够避免种群（个体）发生近交。因此，对杂交鲷家系进行鉴定非常重要，有了杂交鲷家系材料，可以开展鲷鱼生长、抗逆、脂肪酸含量等生物学特性遗传力计算，随后对各性状的育种值进行估计，以指导海水鲷鱼新品种的培育。但水产动物由于难以标识、不易从外部特征鉴别，传统鉴别方式难以发挥作用。
微卫星DNA（Microsatellite DNA），又称简单重复序列（Simple Sequence Repeats, SSR）或短串联重复序列(Short Tandem Repeats, STR)，是指以1~6bp 的短核苷酸为基本单元，首尾相接组成的串联重复序列，由核心序列和两侧的侧翼序列所构成。微卫星DNA广泛分布于真核生物基因组中，且因具有多态性高、重复性好、易于检测、共显性等特性，被广泛应用于海洋生物的遗传结构分析、亲缘关系鉴定、遗传连锁图谱构建等研究中。微卫星DNA的长度一般为100~300bp之间，PCR扩增时，其对样本的质量要求不高，部分降解的基因组DNA样品也能成功扩增，且对样品的需求量少，可以用非损伤性方法获取的极少量样品，尤其适用于濒危物种的研究。
利用微卫星位点的高多态性，高稳定性等特点，以多个位点在一定群体中各等位基因的频率为基础进行亲缘关系鉴定，具有很高的识别率，可以用于鉴别在共同环境下混合家系中某个个体的血缘关系和来源属性，为遗传育种工作带来极大的便利。目前为止，还没有杂交鲷家系的鉴定方法。
发明内容
为了选育优良的杂交鲷家系，本发明提供了一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，该家系的鉴定成功率达99.99%，本发明具有不伤害实验动物、方便快捷、准确率高的特点。
技术方案
一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，包括如下步骤：
（1）剪取真鲷雌鱼和黑鲷雄鱼亲本及其杂交后代尾鳍样品，进行基因组DNA的提取；
（2）以步骤（1）中亲本和杂交后代的DNA为模板，采用微卫星标记引物进行多重PCR扩增；
（3）对步骤（2）的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，电泳图谱用BandScan5.0软件分析，结合PCR产物长度判断等位基因大小，确定个体基因型；
（4）根据步骤（3）的分析结果建立杂交鲷及其亲本的基因型数据文件；
（5）利用Cervus3.0 软件进行家系判别。
步骤（1）中，真鲷雌鱼和黑鲷雄鱼亲本及其杂交后代的基因组DNA的提取方法为： 
1）取鱼鳍组织5~20mg，剪碎后置于1.5mL离心管中，加入400μL组织提取液和10μL蛋白酶K，在振荡器上震荡混匀1min，然后放置在55℃恒温水浴锅中水浴消化2.5 h；
2）往样品中加入300 μL Ext solution和300 μL AB solution，混匀后，12000 rpm离心5min，取下层水相置于GenClean柱中，8000rpm离心1min后，除去废液；
3）往GenClean柱中加入500μL 洗脱液，8000rpm离心1min；
4）重复步骤3）一次；
5）取出GenClean柱，弃去收集管中的废液，将GenClean柱放回收集管中，12000rpm，室温离心1min，以除去残留洗脱液；
6）将GenClean柱放入新的洁净1.5ml离心管中，在柱中央加入50～100 μL Elution Buffer，室温或55℃放置2min后，12000 rpm离心1min，离心管中的液体即为基因组DNA，最后置于-20℃保存备用。
进一步，步骤（2）中，微卫星标记引物为10组，微卫星标记引物1的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，标记位点为AS1；
微卫星标记引物2的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示，标记位点为AS2；
微卫星标记引物3的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示，标记位点为AS3；
微卫星标记引物4的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示，标记位点为AS4；
微卫星标记引物5的上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID NO.10所示，标记位点为AS5；
微卫星标记引物6的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如SEQ ID NO.12所示，标记位点为AS6；
微卫星标记引物7的上游引物序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物序列如SEQ ID NO.14所示，标记位点为AS7；
微卫星标记引物8的上游引物序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物序列如SEQ ID NO.16所示，标记位点为AS8；
微卫星标记引物9的上游引物序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物序列如SEQ ID NO.18所示，标记位点为AS9；
微卫星标记引物1的上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物序列如SEQ ID NO.20所示，标记位点为AS10。
进一步，步骤（2）中，PCR扩增的反应体系（25µL）为：ddH2O 17.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP 0.5μL，引物 2μL，基因组DNA  1μL，Mg2+  1.5μL，Taq酶 0.25μL。
    进一步，步骤（2）中，PCR扩增的反应条件为：94℃预变性10 min；94℃变性 40 s、57.8-62.0℃退火40 s；72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。
进一步，步骤（3）中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用的是8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶。
本发明的有益效果：本发明采用微卫星标记技术，在10个微卫星座位上区分杂交用雌雄亲本和后代的基因型，可以准确、便捷地确定杂交鲷后代的家系来源，对其系谱进行明确的记录，针对生产上体现出来的生长快，抗逆性强等优良性状，确定其基因型，在育种过程中，选择优良个体基因型，淘汰不良个体基因型，可更加快速高效地选育出优良的杂交鲷家系，为遗传育种工作带来极大的便利，实现分子标记辅助育种的目标。
附图说明
图1为位点AS4在亲本及杂交鲷群体的电泳图；
图2为位点AS8在亲本及杂交鲷群体的电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
2014年4月，从200尾真鲷福建群体中选取10尾性腺发育成熟的真鲷雌鱼（记为PR1-PR10）和260尾黑鲷江苏群体中选择12尾性腺发育成熟的黑鲷雄鱼（记为PB1-PB12），按双列杂交方式进行配组，通过人工授精的方法建立了120个家系，待杂交个体生长至90天，剪取尾鳍鳍条，放入100%酒精保存，对20个杂交鲷子代个体（记为HF1-HF20）进行亲缘关系鉴定。
一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，包括如下步骤：
（1）剪取真鲷雌鱼和黑鲷雄鱼亲本及其杂交后代尾鳍样品，进行基因组DNA的提取；
1）取鱼鳍组织5~20mg，剪碎后置于1.5mL离心管中，加入400μL组织提取液和10μL蛋白酶K，在振荡器上震荡混匀1min，然后放置在55℃恒温水浴锅中水浴消化2.5 h；
2）往样品中加入300 μL Ext solution和300 μL AB solution，混匀后，12000 rpm离心5min，取下层水相置于GenClean柱中，8000rpm离心1min后，除去废液；
3）往GenClean柱中加入500μL 洗脱液，8000rpm离心1min；
4）重复步骤3）一次；
5）取出GenClean柱，弃去收集管中的废液，将GenClean柱放回收集管中，12000rpm，室温离心1min，以除去残留洗脱液；
6）将GenClean柱放入新的洁净1.5ml离心管中，在柱中央加入50～100 μL Elution Buffer，室温或55℃放置2min后，12000 rpm离心1min，离心管中的液体即为基因组DNA，最后置于-20℃保存备用。
（2）以步骤（1）中亲本和20个杂交后代的DNA为模板，采用微卫星标记引物进行多重PCR扩增；微卫星标记引物及退火温度见表1：
表1
位点
重复单元
引物序列（5'→3'）
退火温度/℃
产物大小
AS1
(CAA)6
F:AAGATGCTGCGCGATTCAAC
R:ATCTGCTGTCGTACCCGATG
57.8
239-284
AS2
(GT)6
F:CTGGCTGTTCAACTGCACAC
R:CATTCTCCCACTCAACCCCC
59.8
220-250
AS3
(TG)6
F:GCTGAACTGAGGTGGCTGAT
R:AGCTTGAGCAGGACTGAACC
59.8
188-237
AS4
(AG)8
F:TGGTCAGGTTTAGGCAGCTG
R:GCCTCTCACACAGCTCTCTG
59.8 
231-278
AS5
 (TG)6
F:AGTAGGTGATGGGCCGTACT 
R:CTCACCGTCAGCTCCACAAT
 59.8   
251-298
AS6
(AG)8
F:ACACCAATGCTCTTCTCCGG
R:AGATCGACCACAGACCTCCA
59.8
350-405
AS7
(TA)6
F:ACAGTAGGGACAGGTCAGCT 
R:TCCTCTGGGGGACTCTGAAG 
59.8 
250-275
AS8
(AC)6
F:TGTGCGTGTCCACAAGATGA 
R:TCAAGCTTGTGGACAGTGCA 
59.8
178-209 
AS9
(AC)8
F:GCCTGCTCAAACATCTCAGC
R:ACAATCACCTGACCTCCAGT
59.8
186-231
AS10
(CA)8
F:GTGAATGTGCCACAGAGGGA
R:GTGCAAACGCTTTGAGCAGA
62.0
243-283
PCR扩增的反应体系（25µL）为：ddH2O 17.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP 0.5μL，引物 2μL，基因组DNA  1μL，Mg2+  1.5μL，Taq酶 0.25μL。
    PCR扩增的反应条件为：94℃预变性10 min；94℃变性 40 s、退火40 s；72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。
（3）对步骤（2）的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，电泳图谱用BandScan5.0软件分析，结合PCR产物长度判断等位基因大小，确定个体基因型；
（4）根据步骤（3）的分析结果建立杂交鲷及其亲本的基因型数据文件；
（5）利用Cervus3.0 软件进行家系判别。
图1为位点AS4在亲本及杂交鲷群体的电泳图，电泳图上共有43个跑道，从左到右依次为HF1、HF2、HF3、HF4、HF5、HF6、HF7、HF8、HF9、HF10、HF11、HF12、HF13、HF14、HF15、HF16、HF17、HF18、HF19、HF20、M、PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR6、PR7、PR8、PR9、PR10、PB1、PB2、PB3、PB4、PB5、PB6、PB7、PB8、PB9、PB10、PB11、PB12，其中，PR表示真鲷雌鱼，PB表示黑鲷雄鱼，HF表示杂交后代， M表示Marker，由图1可以看出：在微卫星AS4位点，雌性真鲷亲本中PR1、PR3、PR5、PR7、PR8为纯合体，PR2、PR4、PR6、PR9、PR10为杂合体，雄性黑鲷亲本中PB3、PB4、PB6、PB7、PB9、PB10为纯合体，PB1、PB2、PB5、PB8、PB11、PB12为杂合体，后代中HF10、HF15、HF18和HF20号个体为纯合子，其他都为杂合子。
图2为位点AS8在亲本及杂交鲷群体的电泳图，电泳图上共有43个跑道，从左到右依次为PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR6、PR7、PR8、PR9、PR10、PB1、PB2、PB3、PB4、PB5、PB6、PB7、PB8、PB9、PB10、PB11、PB12、M、HF1、HF2、HF3、HF4、HF5、HF6、HF7、HF8、HF9、HF10、HF11、HF12、HF13、HF14、HF15、HF16、HF17、HF18、HF19、HF20，其中，PR表示真鲷雌鱼，PB表示黑鲷雄鱼，HF表示杂交后代， M表示Marker，由图2可以看出：在微卫星AS8位点，雌性真鲷亲本中PR2、PR4、PR5、PR6、PR8、PR10为纯合体，PR1、PR3、PR7、PR9为杂合体，雄性黑鲷亲本中PB3、PB5、PB8、PB10、PB11、PB12为纯合体，PB1、PB2、PB4、PB6、PB7、PB9为杂合体，后代中仅HF4号为纯合子，其他都为杂合子。
确定各位点基因型后，可建立数据库。利用Cervus3.0 软件对本实施例中所有子代基因型数据进行分析，计算等位基因频率和遗传参数，见表2：
表2
位点Loci
Na
Ne
Ho
He
PIC
AS1
4
3.8125
0.4756
0.4153
0.3642
AS2
6
5.6378
0.6824
0.8756
0.7935
AS3
4
3.6973
0.4913
0.5238
0.4736
AS4
3
2.8979
0.2315
0.2478
0.2695
AS5
8
7.6490
0.8972
0.8635
0.8213
AS6
9
8.4396
0.9523
0.8906
0.8614
AS7
4
3.5245
0.5032
0.7425
0.6716
AS8
8
7.8264
0.8895
0.8523
0.8431
AS9
9
8.3469
0.9246
0.8609
0.8823
AS10
5
4.3452
0.6223
0.7958
0.7326
备注：Na，等位基因数；Ne，有效等位基因数；Ho，观测杂合度；He，期望杂合度；PIC，多态信息含量。
由表2可以看出所选的微卫星位点等位基因都在3个以上，多态信息含量0.2695~0.8823，说明所选用的微卫星位点等位基因较多，多态信息含量丰富，适应进行亲子鉴定和种质遗传多样性分析。
有7个位点能在杂交鲷群体中有效扩增，遗传参数均大于黑鲷群体，表明杂交后代较黑鲷具更高的遗传多样性。
基因型数据文件建立好后，利用已知性别的亲本对20个杂家鲷进行家系鉴定，结果见表3：
表3
个体
PR1
PR2
PR3
PR4
PR5
PR6
PR7
PR8
PR9
PR10
PB1
HF1,HF3,HF4,HF7,HF9,HF11


HF15


HF18



PB2

HF13








PB3




HF12





PB4


HF2,HF5,HF8,HF10







PB5





HF20




PB6


HF14







PB7







HF19


PB8


HF16







PB9








HF6

PB10










PB11










PB12









HF17
可以看出，20个个体被成功划分到不同家系，其中6个个体（HF1，HF3，HF4，HF7，HF9，HF11）（记为家系1）来自一对父母本(PR1，PB1)，4个个体(HF2，HF5，HF8，HF10)（记为家系2）来自另一对父母本(PR3，PB4)，2个个体（HF14，HF16）与家系2共享母本PR3，2个个体（HF15，HF18）与家系1共享父本PB1，其余个体分别来自其他的父母本。
 
 
序列表：
SEQ ID NO.1     微卫星标记引物1的上游引物序列
5'-AAGATGCTGCGCGATTCAAC-3'
SEQ ID NO.2     微卫星标记引物1的下游引物序列
5'-ATCTGCTGTCGTACCCGATG-3'
SEQ ID NO.3     微卫星标记引物2的上游引物序列
5'-CTGGCTGTTCAACTGCACAC-3'
SEQ ID NO.4     微卫星标记引物2的下游引物序列
5'-CATTCTCCCACTCAACCCCC-3'
SEQ ID NO.5     微卫星标记引物3的上游引物序列
5'-GCTGAACTGAGGTGGCTGAT-3'
SEQ ID NO.6     微卫星标记引物3的下游引物序列
5'-AGCTTGAGCAGGACTGAACC-3'
SEQ ID NO.7     微卫星标记引物4的上游引物序列
5'-TGGTCAGGTTTAGGCAGCTG-3'
SEQ ID NO.8     微卫星标记引物4的下游引物序列
5'-GCCTCTCACACAGCTCTCTG-3'
SEQ ID NO.9     微卫星标记引物5的上游引物序列
5'-AGTAGGTGATGGGCCGTACT-3'
SEQ ID NO.10     微卫星标记引物5的下游引物序列
5'-CTCACCGTCAGCTCCACAAT-3'
SEQ ID NO.11     微卫星标记引物6的上游引物序列
5'-ACACCAATGCTCTTCTCCGG-3'
SEQ ID NO.12     微卫星标记引物6的下游引物序列
5'-AGATCGACCACAGACCTCCA-3'
SEQ ID NO.13     微卫星标记引物7的上游引物序列
5'-ACAGTAGGGACAGGTCAGCT-3'
SEQ ID NO.14    微卫星标记引物7的下游引物序列
5'-TCCTCTGGGGGACTCTGAAG-3'
SEQ ID NO.15     微卫星标记引物8的上游引物序列
5'-TGTGCGTGTCCACAAGATGA-3'
SEQ ID NO.16    微卫星标记引物8的下游引物序列
5'-TCAAGCTTGTGGACAGTGCA-3'
SEQ ID NO.17     微卫星标记引物9的上游引物序列
5'-GCCTGCTCAAACATCTCAGC-3'
SEQ ID NO.18    微卫星标记引物9的下游引物序列
5'-ACAATCACCTGACCTCCAGT-3'
SEQ ID NO.19     微卫星标记引物10的上游引物序列
5'-GTGAATGTGCCACAGAGGGA-3'
SEQ ID NO.20    微卫星标记引物10的下游引物序列
5'-GTGCAAACGCTTTGAGCAGA-3'